ELISA的基礎是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。在測定時(shí)，受檢標本（測定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與液體中的其他物質(zhì)分開(kāi)。再加入酶標記的抗原或抗體，也通過(guò)反應而結合在固相載體上。此時(shí)固相上的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。

二．實(shí)驗材料與試劑配制

1.儀器與材料：酶標儀（使用前預熱30分鐘），微量加液器、吸頭、蒸餾水或去離子水，濾紙。

2. 洗液的配制：按1:30的比例配制洗液備用。

三．樣品收集、處理及保存

1）.細胞培養上清：

適用于檢測體外培養的細胞分泌性成份。用無(wú)菌管收集細胞上清液，以1000×g離心15分鐘，收集上清。

2）細胞：

用PBS反復洗滌細胞3次，調整細胞濃度達到104-106/ml 左右，通過(guò)反復凍融，使細胞破壞并放出細胞內成份，或者細胞超聲粉碎，離心取上清液檢測。

3）血清：

在室溫下，血液自然凝固，以1000×g離心15分鐘，取上清待測。

4）血漿：

應根據標本的要求選擇EDTA 或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合后靜置10-20 分鐘后，以1000×g離心15分鐘，收集上清。

5）體液：

包括胸腹水、腦脊液，分泌物等。使用不含熱原和內毒素的離心管收集，以1000×g離心15分鐘，收集上清。

6.）組織標本：

切取組織標本，稱(chēng)取重量0.5mg，加入500ul 的PBS，用手工或勻漿器，或超聲破碎儀將標本勻漿，以2000-3000 rmp離心20 分鐘，收集上清進(jìn)行檢測。

樣品中不能含有NaN3，因NaN3 抑制辣根過(guò)氧化物酶的（HRP）活性。

7）保存：

如果樣品不能立即檢測，應將其分裝，-70 ℃保存，避免反復冷凍。保存過(guò)程中如出現沉淀，應再次離心。血液標本盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中含大量顆粒，檢測前先離心或過(guò)濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

四．操作步驟

1）取出試劑盒，室溫（20-25℃）放置30分鐘。

2）分組：取出96孔板，根據待測樣品數量加上標準品的數量決定所需的板條數，把剩余的板條繼續冷藏處理。分別設標準品組（6個(gè)濃度）、空白孔、待測樣品組。

3）標準品的稀釋?zhuān)簻蕚湫≡嚬?/font>6 只，依次編好號碼，先在各小試管中加入標準品稀釋液100ul，然后取原濃度標準品100ul加入一只已編好號的試管中，充分混勻;再在該試管中取100ul 加入第二支試管中，充分混勻；再在該試管中取100ul加入第三只試管中，充分混勻；再在該試管中取100ul 加入第四只試管中，充分混勻；再在該試管中取100ul加入第五只試管中，充分混勻；然后在該試管中取100ul，棄掉。第六只試管作為0 號標準品。

注：為減少實(shí)驗誤差，保證準確性，建議設置復孔。

4）加樣：依照標準品的順序分別加入50ul的標準品溶液于空白微孔中；空白對照孔加入50ul的蒸餾水；其余微孔中先加樣品40ul然后再加生物素標記的抗體10ul。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。

5）溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30 分鐘。

6）洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿(mǎn)洗滌液，靜置30 秒棄去，如此重復5 次，拍干。

7）加酶標溶液：標準品組、待測樣本組各孔中加入50ul的酶標溶液（空白對照孔除外）。

8）溫育：酶標板用封板紙密封后，放入濕盒內于37℃恒溫孵育1小時(shí)。

9）洗板：用稀釋后的洗滌液注滿(mǎn)每孔，靜置15-30s，充分清洗酶標板5次，用吸水紙徹底拍干。

10）顯色：各孔加入顯色劑A液50ul后，再加入顯色劑B液50ul。

11）終止：25-37℃下避光反應10-15分鐘，加入50ul終止液。

12）讀板：在450nm波長(cháng)讀取各孔的OD值。

注：讀板時(shí)必須拭干板底殘留的液體和手指痕跡，讀板時(shí)間控制在終止反應后的30分鐘內，以免影響準確性。

五．數據計算

以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線(xiàn)，根據樣品的OD值由標準曲線(xiàn)查出相應的濃度；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線(xiàn)的直線(xiàn)回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，即為樣品的實(shí)際濃度。

六．注意事項

1）實(shí)驗操作中必須使用一次性吸頭，避免交叉污染。

2）加樣：加樣時(shí)，要控制加樣速度，避免孔與*后一孔間的時(shí)間間隔過(guò)大，否則將會(huì )導致不同的預孵育時(shí)間，從而影響實(shí)驗的準確性以及重復性。

3）孵育：嚴格按照說(shuō)明書(shū)上規定的孵育時(shí)間和溫度進(jìn)行。

反應時(shí)間的控制：加入底物后請定時(shí)觀(guān)察反應孔的顏色變化，如果顏色較深，請提前加入終止液終止反應。

4）建議實(shí)驗前預測樣品含量，如樣品濃度過(guò)高，應對樣品進(jìn)行稀釋?zhuān)�計算結果時(shí)乘以相應的稀釋倍數。

5）建議使用本試劑盒時(shí)先做預實(shí)驗（即先做標準曲線(xiàn)，試用幾個(gè)標本），如果對本試劑盒有任何疑問(wèn)，可和所購經(jīng)銷(xiāo)商聯(lián)系，如果因運輸過(guò)程導致試劑盒失效，可要求調換，但概不承擔產(chǎn)品本身以外的任何損失。

七．保存條件及有效期

1.試劑盒保存：2-8℃

2.有效期：6個(gè)月

八．訂貨說(shuō)明

1）賣(mài)方確保所訂產(chǎn)品與目錄技術(shù)指標保持一致；

2）為了確保買(mǎi)方產(chǎn)品在運輸中的質(zhì)量，對有特殊要求的低溫產(chǎn)品予以濕冰運輸。

3）收到貨物后如出現質(zhì)量問(wèn)題，買(mǎi)方需在收到貨物一個(gè)月內向賣(mài)方提出書(shū)面異議。買(mǎi)方逾期不提出異議，視為貨物符合其要求，賣(mài)方不付任何責任。

4）出現質(zhì)量以外的問(wèn)題，如破損等，買(mǎi)方應在收貨后一個(gè)周內提出。買(mǎi)方未按時(shí)提出異議，視為該產(chǎn)品合格。

本公司對所有售出的產(chǎn)品保證質(zhì)量，并提供良好的售后服務(wù)，有關(guān)產(chǎn)品質(zhì)量的投訴，請在收到貨物的32天內以書(shū)面形式提出，并向我公司技術(shù)人員提供相應的材料，我們會(huì )及時(shí)派人解決。所有形式的賠償或退換僅限于產(chǎn)品本身，不涉及其他間接內容。凡購買(mǎi)本公司任意款elisa試劑盒，均可享受免費代測服務(wù)，并提供技術(shù)指導。